Die altehrwürdige Tradition, dass jede übergeordnete Regulierungsbehörde ihre eigene Leitlinie zum selben Thema veröffentlicht, lebt fort. Der Nachweis von Wirtszellverunreinigungen in biotechnologisch hergestellten Produkten ist keine Ausnahme: Die Europäische Arzneimittel-Agentur (EMA) und die Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) haben jeweils eigene Anforderungen veröffentlicht.
Biotechnologische Verfahren werden in großem Umfang zur Herstellung von Arzneimittelwirkstoffen (APIs) für Human- und Tiermedizin eingesetzt. Humaninsulin, eines der ersten Biotechnologieprodukte, wird in Europa seit 1994 zur Behandlung des Diabetes mellitus biotechnologisch hergestellt. Viele weitere rekombinante Proteine sind seither auf den Markt gekommen. 2022 waren rund 59 % aller in Deutschland zugelassenen Arzneimittel Biopharmazeutika (wie der Verband Forschender Arzneimittelhersteller e.V. kürzlich im Biotech-Report 2023 berichtete). Für biopharmazeutische Produkte in der Human- und Tiermedizin ist die Europäische Arzneimittel-Agentur (EMA) zuständig.
Die Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) berät unabhängig und wissenschaftlich zu lebensmittelbezogenen Risiken. Sie ist an der Marktzulassung nahezu aller Lebensmittelzutaten beteiligt, die in der Europäischen Union verwendet werden sollen. Unter anderem bewertet die EFSA auch neuartige Lebensmittel (Novel Food) und neuartige Lebensmittelzutaten aus zellulärer Landwirtschaft. Bei den meisten dieser Herstellungsverfahren spielt die Biotechnologie eine grundlegende Rolle – ob mit oder ohne Gentechnik.
Die Anforderungen an die Produktqualität unterscheiden sich jedoch erheblich. Viele Wirtsorganismen (z. B. Pichia pastoris) können sowohl für die biopharmazeutische Produktion als auch für die Herstellung neuartiger Lebensmittelzutaten eingesetzt werden – für die Zulassung des jeweiligen Produkts ist aber eine andere Behörde zuständig.
Die Validierung analytischer Methoden gegen eine empfohlene Nachweisgrenze für Wirtszell-DNA-Verunreinigungen ist eine grundlegende Anforderung der FDA – aber keine Anforderung der EMA.
Die wissenschaftliche Leitlinie der EMA „DNA and host cell protein impurities, routine testing versus validation studies“ legt keine Nachweisgrenze (Limit of Detection, LoD) für genomische Wirtszell-DNA-Verunreinigungen im biotechnologischen Endprodukt fest.
Der International Council for Harmonisation (ICH) stellt mehrere Qualitätsleitlinien bereit, die die regulatorischen Erwartungen an biopharmazeutische Produkte beschreiben. So müssen etwa prozessbedingte Verunreinigungen aus dem für die rekombinante Proteinexpression verwendeten Wirtsorganismus im Endprodukt charakterisiert werden. Auch ICH Q6B (Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products) definiert jedoch keinen Nachweisschwellenwert. Im Wesentlichen scheint es auszureichen, dass der (nicht näher bestimmte) „level of DNA from the host cells can be detected by direct analysis on the product (such as hybridization techniques“ (siehe Abschnitt 6.2.1 der von der EMA übernommenen Leitlinie ICH Q6B).
Alles scheint auf einer produktspezifischen Risikobewertung zu beruhen: Wie Rest-DNA aus Wirtszellen im Endprodukt bewertet wird, kann von der Art des Wirts und seiner Genomstruktur sowie von der Art der für die Produktion verwendeten rekombinanten DNA abhängen.
Die US-amerikanische Food and Drug Administration (FDA) vertritt in der „Guideline for Industry: Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications“ eine andere Auffassung. Abschnitt C.2 besagt: „you should limit residual DNA for continuous non-tumorigenic cells, such as low-passage Vero cells, to less than 10 ng/dose for parenteral inoculation.“ Vero-Zellen werden häufig für die Herstellung von Gentherapeutika verwendet.
Auch die Weltgesundheitsorganisation (WHO) hat ihre Erwartungen in TRS 987 Annex 4 „Guidelines on the quality, safety and efficacy of biotherapeutic protein products prepared by recombinant DNA technology“ klar formuliert. Abschnitt A.4.2.1 besagt: „in general, it has been possible to reduce rcDNA levels in rDNA-derived biotherapeutics to <10 ng per dose.“
Doch was bedeutet das in der Praxis? Sehen wir uns ein aktuelles Beispiel für einen von der EMA zugelassenen rekombinanten Proteinimpfstoff an: AREXVY. Der weltweit erste Impfstoff gegen das Respiratorische Synzytial-Virus (RSV) ist im Wesentlichen ein rekombinantes RSV-spezifisches Antigen, das Glykoprotein F. Die FDA hat AREXVY im vergangenen Jahr zugelassen und stellt in der Packungsbeilage (englisch) genauere Dosierungsangaben bereit.
Nach der Rekonstitution enthält jede Dosis von 0,5 ml 120 Mikrogramm des rekombinanten Antigens RSVPreF3. Jede Dosis muss, wie von WHO und FDA gefordert, weniger als 10 ng Wirtszell-rDNA enthalten; die Packungsbeilage nennt jedoch < 0,80 ng pro Milligramm Produkt. Auf ein Gramm Endprodukt hochgerechnet, entsprechen fast 800 ng Wirtszell-rDNA pro Gramm Produkt also noch den Erwartungen von WHO und FDA.
Spielt die analytische Validierung auch eine Rolle, wenn bei der EFSA ein Dossier für aus GVO gewonnene neuartige Lebensmittel oder Lebensmittelzutaten eingereicht wird?
Die Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) sagt JA und hat die „Guidance on the characterisation of microorganisms used as feed additives or as production organisms“ veröffentlicht. EFSA Journal 2018;16(3):5206, 24 S. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2018.5206
Abschnitt 3.2 „Presence of DNA from the production strain“ gibt eine klare Empfehlung: „The presence of DNA from the production strain should be tested in the product by PCR [...] having detection threshold of 10 ng of DNA per gram or mL of product or lower.“ Die Herausforderung besteht darin, genügend Produktmaterial für Aufstockungsversuche (Spiking) herzustellen und mit der Methodenvalidierung zu beginnen, z. B. nach der Leitlinie ICH Q2(R2). Doch ab wann verfügt man über genügend Produktmaterial (z. B. Soja-Leghämoglobin), um mit Spiking-Kontrollen zu beginnen, wie es die EFSA-Leitlinie vorschlägt?
Als Beispiel dafür, wie unzureichende oder unvollständige Dossiers die Bearbeitung eines Antrags extrem verzögern können, befasste sich die 156. Plenarsitzung des GVO-Gremiums am 15.–16. März 2023 mit einem Antrag auf Inverkehrbringen von Soja-Leghämoglobin, hergestellt aus gentechnisch verändertem Komagataella phaffii (früher Pichia pastoris; EFSA-Antrag Nr. EFSA-GMO-NL-2019-162).
Nach der EFSA-„Guidance on the risk assessment of genetically modified microorganisms and their products intended for food and feed use“, EFSA Journal 2011; 9( 6):2193, 54 S. https://doi:10.2903/j.efsa.2011.2193, könnte das Produkt der Kategorie 2 „Complex product in which both GMMs and newly introduced genes are no longer present, e.g. cell extracts, most enzyme preparations“ zugeordnet werden. Für diesen Antrag bleibt die Uhr angehalten, bis die EFSA unter anderem zusätzliche Informationen zur „method used to estimate the presence of the recombinant DNA“ erhält. Diese Informationen fehlten offenbar im Dossier. Das von Food Standards Australia zugelassene Soja-Leghämoglobin darf weniger als 300 mg DNA pro Liter enthalten (die Masse wurde nicht angegeben). Wird dies zum Stolperstein für das EFSA-Dossier?
Weitere Informationen finden Sie unter: https://open.efsa.europa.eu/questions/EFSA-Q-2019-00651. Interessanterweise hat der Antragsteller das Dossier beim Norwegischen Wissenschaftlichen Ausschuss für Lebensmittel und Umwelt (VKM) eingereicht.
Als Beispiel dafür, dass sich die DNA-Nachweisanforderungen der EFSA durchaus erfüllen lassen, veröffentlichte die EFSA eine „Scientific Opinion on the safety evaluation of the food enzyme phospholipase C from a genetically modified Komagataella phaffii (strain PRF)“. EFSA Journal 2019;17(4):5682, 12 S. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2019.5682.
Abschnitt 3.4 hält fest, dass „no DNA was detected with primers that would amplify a 999-bp fragment specific for a region containing the alphaMF-PLC gene, with a limit of detection (LoD) of 1 ng spiked DNA/g food enzyme“ – das ist zehnmal empfindlicher, als die Leitlinie fordert, und wurde selbstverständlich im Produkt mittels PCR geprüft.
Fazit
Für biopharmazeutische Produkte (Beispiel: AREXVY) liegt der Grenzwert für Wirtszell-DNA-Verunreinigungen entsprechend den Erwartungen von WHO und FDA bei 10 ng DNA pro verabreichter Dosis. Tatsächlich darf AREXVY bis zu 800 ng pro Gramm Produkt enthalten, was für die intramuskuläre Anwendung beim Menschen akzeptiert wurde.
Für biotechnologisch gewonnene neuartige Lebensmittelzutaten (Beispiel: Soja-Leghämoglobin) liegt der Grenzwert entsprechend den deutlich strengeren Erwartungen der EFSA bei 10 ng DNA pro Gramm Produkt – obwohl das Produkt nur als Lebensmittelzutat verwendet werden soll.
In beiden Fällen sollte der Antragsteller nachweisen, dass die Analysenmethode zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse liefert. Auch wenn die Behörde keine formale Methodenvalidierung verlangt, kann es sinnvoll sein, sich an den Leitlinien ICH Q2(R2)/Q14 zu orientieren.
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Letzte Aktualisierung dieses Beitrags: Sonntag, 4. Juni 2023, von Christian Lange.
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