La vénérable tradition voulant que chaque autorité réglementaire de rang supérieur publie sa propre ligne directrice sur un même sujet se porte bien. La détection des impuretés issues des cellules hôtes dans les produits biotechnologiques ne fait pas exception : l’Agence européenne des médicaments (EMA) et l’Autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA) ont chacune publié leurs propres exigences.
Les procédés biotechnologiques sont largement utilisés pour produire des principes actifs pharmaceutiques (API) à usage humain et vétérinaire. L’insuline humaine, l’un des premiers produits biotechnologiques, est produite par biotechnologie en Europe depuis 1994 pour le traitement du diabète sucré. De nombreuses autres protéines recombinantes ont depuis été mises sur le marché. En 2022, environ 59 % de tous les médicaments autorisés en Allemagne étaient des biomédicaments (comme l’a récemment indiqué le Verband Forschender Arzneimittelhersteller e.V. dans son rapport biotech 2023). Pour les produits biopharmaceutiques à usage humain et vétérinaire, l’autorité compétente est l’Agence européenne des médicaments (EMA).
L’Autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA) fournit des avis scientifiques indépendants sur les risques liés à l’alimentation. Elle intervient dans l’autorisation de mise sur le marché de presque tous les ingrédients alimentaires destinés à être utilisés dans l’Union européenne. L’EFSA évalue notamment les nouveaux aliments (novel food) et les nouveaux ingrédients alimentaires issus de l’agriculture cellulaire. Dans la plupart de ces procédés de production, la biotechnologie joue un rôle fondamental, qu’il y ait ou non recours au génie génétique.
Les exigences de qualité des produits diffèrent toutefois considérablement. De nombreux organismes hôtes (p. ex. Pichia pastoris) peuvent servir aussi bien à la production biopharmaceutique qu’à la production de nouveaux ingrédients alimentaires – mais l’autorisation de chaque produit relève d’une autorité différente.
La validation des méthodes analytiques par rapport à une limite de détection recommandée pour les impuretés d’ADN des cellules hôtes est une exigence fondamentale de la FDA – mais pas de l’EMA.
La ligne directrice scientifique de l’EMA « DNA and host cell protein impurities, routine testing versus validation studies » ne fixe pas de limite de détection (LoD) pour les impuretés d’ADN génomique des cellules hôtes dans le produit biotechnologique final.
Le Conseil international d’harmonisation (ICH) publie plusieurs lignes directrices qualité décrivant les attentes réglementaires pour les produits biopharmaceutiques. Par exemple, les impuretés liées au procédé provenant de l’organisme hôte utilisé pour l’expression de la protéine recombinante doivent être caractérisées dans le produit final. Toutefois, l’ICH Q6B (Specifications: Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products) ne définit pas non plus de seuil de détection. Pour l’essentiel, il semble suffire que le « level of DNA from the host cells can be detected by direct analysis on the product (such as hybridization techniques » (non spécifié ; voir la section 6.2.1 de la ligne directrice ICH Q6B adoptée par l’EMA).
Tout semble reposer sur une évaluation des risques propre au produit : la manière dont l’ADN résiduel des cellules hôtes est évalué dans le produit final peut dépendre du type d’hôte et de sa structure génomique, ainsi que du type d’ADN recombinant utilisé pour la production.
La Food and Drug Administration (FDA) américaine adopte une position différente dans la « Guideline for Industry: Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications ». La section C.2 indique que « you should limit residual DNA for continuous non-tumorigenic cells, such as low-passage Vero cells, to less than 10 ng/dose for parenteral inoculation. » Les cellules Vero sont largement utilisées pour la production de thérapies géniques.
L’Organisation mondiale de la santé (OMS) a elle aussi clairement exposé ses attentes dans le TRS 987, annexe 4 « Guidelines on the quality, safety and efficacy of biotherapeutic protein products prepared by recombinant DNA technology ». La section A.4.2.1 indique que « in general, it has been possible to reduce rcDNA levels in rDNA-derived biotherapeutics to <10 ng per dose. »
Mais qu’est-ce que cela signifie en pratique ? Prenons un exemple récent de vaccin à protéine recombinante autorisé par l’EMA : AREXVY. Premier vaccin au monde contre le virus respiratoire syncytial (VRS), il s’agit essentiellement d’un antigène recombinant spécifique du VRS, la glycoprotéine F. La FDA a autorisé AREXVY l’an dernier et fournit des informations posologiques plus détaillées dans la notice (en anglais).
Après reconstitution, chaque dose de 0,5 ml est formulée pour contenir 120 microgrammes de l’antigène recombinant RSVPreF3. Chaque dose doit contenir moins de 10 ng d’ADNr de cellules hôtes, comme l’exigent l’OMS et la FDA ; la notice indique toutefois < 0,80 ng par milligramme de produit. Extrapolé à un gramme de produit final, près de 800 ng d’ADNr de cellules hôtes par gramme de produit restent donc conformes aux attentes de l’OMS et de la FDA.
La validation analytique joue-t-elle également un rôle lors du dépôt auprès de l’EFSA d’un dossier relatif à de nouveaux aliments ou ingrédients alimentaires issus d’OGM ?
L’Autorité européenne de sécurité des aliments (EFSA) répond OUI et a publié la « Guidance on the characterisation of microorganisms used as feed additives or as production organisms ». EFSA Journal 2018;16(3):5206, 24 p. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2018.5206
La section 3.2 « Presence of DNA from the production strain » donne une recommandation claire : « The presence of DNA from the production strain should be tested in the product by PCR [...] having detection threshold of 10 ng of DNA per gram or mL of product or lower. » Le défi consiste à produire suffisamment de produit pour les essais de dopage (spiking) et à lancer la validation de la méthode, par exemple selon la ligne directrice ICH Q2(R2). Mais à partir de quand dispose-t-on de suffisamment de produit (p. ex. de léghémoglobine de soja) pour commencer les contrôles de dopage suggérés par la ligne directrice de l’EFSA ?
Pour illustrer combien des dossiers insuffisants ou incomplets peuvent retarder considérablement le traitement d’une demande : la 156e réunion plénière du groupe scientifique OGM, les 15 et 16 mars 2023, a examiné une demande de mise sur le marché de léghémoglobine de soja produite à partir de Komagataella phaffii génétiquement modifiée (anciennement Pichia pastoris ; demande EFSA n° EFSA-GMO-NL-2019-162).
Selon la « Guidance on the risk assessment of genetically modified microorganisms and their products intended for food and feed use » de l’EFSA, EFSA Journal 2011; 9( 6):2193, 54 p. https://doi:10.2903/j.efsa.2011.2193, le produit pourrait relever de la catégorie 2 « Complex product in which both GMMs and newly introduced genes are no longer present, e.g. cell extracts, most enzyme preparations ». Pour cette demande, le délai reste suspendu jusqu’à ce que l’EFSA reçoive notamment des informations complémentaires sur la « method used to estimate the presence of the recombinant DNA ». Ces informations manquaient manifestement dans le dossier. La léghémoglobine de soja autorisée par Food Standards Australia peut contenir moins de 300 mg d’ADN par litre (la masse n’était pas précisée). Sera-ce la pierre d’achoppement du dossier EFSA ?
Pour plus d’informations, suivez ce lien : https://open.efsa.europa.eu/questions/EFSA-Q-2019-00651. Fait intéressant, le demandeur a soumis le dossier au Comité scientifique norvégien pour l’alimentation et l’environnement (VKM).
Pour montrer que les exigences de l’EFSA en matière de détection de l’ADN peuvent effectivement être satisfaites, l’EFSA a publié un « Scientific Opinion on the safety evaluation of the food enzyme phospholipase C from a genetically modified Komagataella phaffii (strain PRF) ». EFSA Journal 2019;17(4):5682, 12 p. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2019.5682.
La section 3.4 reconnaît que « no DNA was detected with primers that would amplify a 999-bp fragment specific for a region containing the alphaMF-PLC gene, with a limit of detection (LoD) of 1 ng spiked DNA/g food enzyme », soit une sensibilité dix fois supérieure à celle exigée par la ligne directrice – et ce, bien entendu, testé dans le produit par PCR.
Conclusion
Pour les produits biopharmaceutiques (exemple : AREXVY), la limite applicable aux impuretés d’ADN des cellules hôtes est de 10 ng d’ADN par dose administrée, conformément aux attentes de l’OMS et de la FDA. En réalité, AREXVY peut contenir jusqu’à 800 ng par gramme de produit, ce qui a été accepté pour une administration intramusculaire chez l’homme.
Pour les nouveaux ingrédients alimentaires d’origine biotechnologique (exemple : léghémoglobine de soja), la limite est de 10 ng d’ADN par gramme de produit, conformément aux attentes bien plus strictes de l’EFSA – alors même que le produit est destiné à être utilisé uniquement comme ingrédient alimentaire.
Dans les deux cas, le demandeur doit démontrer que la méthode analytique fournit des résultats fiables et reproductibles. Même lorsque l’autorité n’exige pas de validation formelle de la méthode, il peut être judicieux de suivre les lignes directrices ICH Q2(R2)/Q14.
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Dernière mise à jour de cet article : dimanche 4 juin 2023, par Christian Lange.
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